精液顯微鏡檢查,或稱精液有形成分分析,包括精子活動率、精子活動力、精子計數、精子形態分析和精子凝集現象檢查及其他有形成分檢查等,需采用標準化的操作和計數方能獲得準確和可靠的結果。
(一)精子活動率
精子活動率是活動精子占精子總數的百分率。射精30~60 min內精子活動率達到80%~90%;顒勇<40%,應進行精子活體染色,檢查精子的存活率。常用檢測方法為伊紅-苯胺黑染色法和低滲腫脹試驗來鑒別細胞膜完整的精子,鑒別不動死精子和不動活精子,大量活而不動精子提示精子尾部結構缺陷;大量死精子提示附睪存在疾病或感染所致免疫反應[19]?偩訑25%~30%為活而不動精子,提示為遺傳性纖毛問題[20]。
(二)精子活動力
精子活動力是評估男性生育能力的重要指標。檢測常用傳統顯微鏡法、連續攝影法和精子質量分析法。(1)顯微鏡法:傳統鏡檢方法受檢驗者的主觀影響因素較大;(2)連續攝影法:計算機視頻顯微照相術和實時顯微照相術可客觀評價精子的活動力和形態;(3)精子質量分析法:WHO推薦使用評估精子活力等級的簡單系統。精子質量分析儀具有操作便捷,準確、客觀的特點,是較為理想的精子活力分析法。
WHO將精子活動力分為4級:(1)a級:精子快速向前運動,37 ℃,精子速度≥25 μm/s,或20 ℃,精子速度≥20 μm/s;(2)b級:慢速或呆滯地向前運動;(3)c級:非前向運動(精子速度<5 μm/s);(4)d級:不動。正常標本采集后60 min內,≥50%的精子呈中度或快速直線運動。但生理情況下,射精后數分鐘精子離開精液進入宮頸黏液,因此精子活動力評價的意義有限。
(三)精子計數
精子計數包括精子密度和精子總數。精液中精子濃度與受精率和妊娠率相關,一次射精,精子數達到(20~250)×106/ml考慮為正常,減低或增高均可引起不育。精子計數<20×106/ml為少精子癥;精液多次檢查無精子時稱為無精子癥。WHO推薦血細胞計數板法進行精子計數,也可采用精子專用計數板法。健康人的精子數量存在著明顯的個體差異,同一個體的精子數量變化范圍也很大,受禁欲時間、病毒感染和精神壓力等因素影響。
(四)精子形態分析
精子形態分析采用計算機技術客觀的評價精子頭部長度、寬度、周長和面積,但尚無公認的正常參考區間。嚴格來講,只有頭、頸、中段和尾部都正常的精子才能稱為正常精子。正常精子頭部成橢圓形,長度4.0~5.0 μm,寬度2.5~3.5 μm,頂體界限清楚,占頭部40%~70%;中段細,長度6~8 μm,寬度不超過1 μm;尾部長度至少45 μm,細長無卷曲。精子頭部出現明顯畸形、缺陷或不規則、空泡,頸部和尾部出現雙尾、斷裂、彎折等,均可判定為異常精子。簡單的形態學評價將精子分為正常和異常兩類。若進行全面詳細形態學評價,可將精子分為5類:正常、頭部缺陷、頸部和中段缺陷、尾部缺陷、胞質小滴(位于精子中段,該區域大于正常精子頭部的1/3)。
WHO推薦使用巴氏染色法進行精子形態分析,也可使用Shorr染色法或Diff-Quik快速染色法,但需要與標準方法進行比對和驗證。生育力正常男性中,正常形態精子比例應超過50%,低于5%,多提示不育。生育者正常形態精子多超過12%~15%,且生育組和不育組相比,精子頭部長度和寬度比率差異有統計學意義。不推薦使用濕片法精子形態檢查,染色法雖然操作相對復雜,但染色后精子形態易于辨認,結果準確性和重復性較好。
(五)精子凝集現象檢查
精子凝集時活動精子以各種方式(如頭對頭,尾對尾或混合型)相互黏附在一起的現象。以分級方式報告。(1)1級:零散的,每個凝集<10個精子,有很多自由活動的精子;(2)2級:中等的,每個凝集<10~50個精子,存在自由活動精子;(3)3級:大量的,每個凝集>50個精子,仍有一些活動的精子;(4)4級:全部的,所有精子凝集,數個凝集又粘連在一起。此外,也可以采用“-”(無凝集)~“3+”(所有可動精子凝集在一起)的形式報告。精子凝集現象的存在提示存在抗精子抗體,免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白A(IgA)抗體與免疫學不育有密切聯系,但需進一步實驗證明,如免疫珠試驗、混合抗人球蛋白試驗來鑒別抗體種類。單憑此現象不足以推斷免疫因素介導的不育癥。
(六)精液中其他有形成分檢查
正常精液中除精子外,還會出現其他細胞,如尿路上皮細胞、白細胞、未成熟生精細胞,以及細胞碎片和各種顆粒。因這些細胞大小和細胞核形狀類似,存在鑒別困難。WHO推薦采用過氧化物酶染色來識別白細胞(過氧化物酶陽性)、生精細胞、淋巴細胞(過氧化物酶陰性),從而鑒別感染和不育癥。此外,精液過氧化物酶常規檢查可作為基礎的篩查手段[21]。
白細胞還可以借助免疫細胞化學檢查進一步區分為正常白細胞和攜帶精子抗原白細胞。過氧化物酶陽性細胞≥1×106/ml,認為精液白細胞總數存在異常,與感染和精子質量降低存在關聯。白細胞可以通過氧自由基攻擊影響精子活動力和DNA完整性。而白細胞滲透能夠對精子造成損傷依賴于一些無法從精液標本獲得的信息,如滲透的時間和解剖學定位以及白細胞本身性質和是否處于激活狀態。
多形核白細胞會釋放胞內顆粒,而其他類型白細胞,如淋巴細胞、巨噬細胞或單核細胞胞內不含過氧化物酶,不能被鄰甲苯胺染色,但可通過免疫細胞化學途徑實現。免疫細胞化學染色法與中性粒細胞過氧化物酶活性評估相比,價格昂貴,較為費時,但可區分白細胞和精原細胞。
臨床實驗室可使用全白細胞抗體CD45+單克隆抗體對精漿中的細胞進行染色以區分白細胞和生殖細胞。目前尚無生育能力正常男性人群精漿中CD45+細胞濃度參考值,但普遍認為過氧化物酶陽性細胞>1.0×106/ml,提示精漿中白細胞總數較高。
建議2:精子活動力檢查是通過評估精子細胞膜的完整性,常規地確定所有精子的生命力,但在總活動率為40%以上時,不建議進行此項檢查。
建議3:精子形態學檢查首選巴氏染色法,也可使用Shorr染色法或Diff-Quik快速染色法。臨床實驗室必須建立本實驗室標準操作方法和精子形態判斷標準,不推薦采用濕片鏡檢法進行精子形態學檢查。
建議4:精子凝集現象提示存在抗精子抗體,但單憑此現象不足以推斷免疫因素介導的不育癥,需進一步進行相關實驗室檢查。